конкурентный анализ

li.navhl { background-image: none;} li.navHighlight { background-image: url(http://www.wipo.int/export/sites/www/shared/images/icon/icon_arrow_right.gif); background-position: left top; background-repeat: no-repeat;} (WO/2006/062427) METHOD FOR QUANTITATIVELY DETECTING BIOLOGICAL TOXINS (WO/2006/062427) METHOD FOR QUANTITATIVELY DETECTING BIOLOGICAL TOXINS Biblio. DataDescription Claims National PhaseNoticesDocuments Note: OCR Text Note: Text based on automatic Optical Character Recognition processes. Pleaseuse the PDF version for legal matters СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОБНАРУЖЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТОКСИНОВ Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к аналитической биохимии и количественному иммунохимическому анализу и касается количественного обнаружения различных биологических токсинов иммунохимическим методом с использованием трехмерных микрочипов на основе гидрогелей. Предлагаемый способ обнаружения биотоксинов может быть использован в медицине, в пищевой промышленности, в охране окружающей среды. В настоящее время разработка быстрых и чувствительных методов анализа биологических токсинов приобретает важное значение в связи с угрозой биотерроризма, так как многие природные токсины могут быть использованы в качестве компонентов биологического оружия. Уровень техники В настоящее время хорошо известны многие бактериальные, растительные и животные токсины, обладающие сильным токсическим действием на человеческий организм. К наиболее сильным токсинам, продуцируемым микроорганизмами, относятся ботулинический, столбнячный и холерный токсины; из токсинов растительного происхождения наиболее сильными являются рицин и абрин. Существует также множество токсинов, секретируемых ядовитыми животными: змеями, пауками, скорпионами и т.д. Большинство биотоксинов имеют полипептидную природу, однако известны и низкомолекулярные соединения, имеющие высокую токсичность, например, тетродотоксин (иглобрюхие рыбы), T-2 токсин (грибы), токсины сине-зеленых водорослей. Для идентификации и анализа как самих токсинов, так и организмов, которые их вырабатывают, в настоящее время используются различные лабораторные методы, включающие тесты на животных, микробиологические методы, анализ ДНК с использованием ПЦР, иммунологические методы: прямой и непрямой радиоиммунологический, иммунофлуоресцентный и иммуноферментный анализ. Наиболее чувствительным, быстрым и удобным методом анализа токсинов является иммунохимический метод с использованием антител против токсинов. Чувствительность иммуноанализа биотоксинов с использованием классического "плашечного" варианта достигает 0,01-1 нг вещества в 1 мл исследуемого раствора (например, в случае рицина [1], стафилококкового энтеротоксина В [2], дифтерийного токсина [3]). [1] М.А. PoIi, V.R. Rivеrа, J.F. Неvеtsоп, G.А. Меrril, Dеtесtiоп оf riсiп bу соlоrimеtriс and chemiluminescence ELISA, Тохiсоп, 1994, 32, 1371-1377. [2] М.А. PoIi, V.R. Rivеrа, D. Nеаl, Sепsitivе апd sресifiс соlоrimеtriс ELISAs fоr Stарhуlососсus аurеus епtеrоtохiпs A and B iп uriпе апd buffеr, Тохiсоп, 2002, 40, 1723- 1726. [3] K.H. Епglеr, А. Еfstrаtiоu, Rарid епzуmе immuпоаssау fоr dеtеrmiпаtiоп оf tохigепiсitу аmопg сliпiсаl isоlаtеs оf соrупеbасtеriа, J. CHn. МiсrоbiоL, 2004, 38, 1385- 1389. Традиционные иммунологические методы не позволяют проводить одновременный тест на наличие нескольких токсинов в образце, поэтому существует необходимость разработки быстрого, чувствительного и эффективного метода одновременного параллельного анализа. Параллельный анализ образцов на присутствие нескольких соединений достигается при использовании микрочипов — массивов индивидуальных ячеек, содержащих различные зонды (белки, рецепторы, антитела, антигены и др.). Проведение одновременного анализа образца по многим параметрам, значительно увеличивает эффективность анализа, позволяет миниатюризировать проведение исследований и значительно снижает количество исследуемого материала. Описано применение чипов различной конструкции для детекции биологических токсинов. Для одновременного иммунологического определения биологических токсинов предложен чип-биосенсор на основе иммобилизованных антител против биотоксинов [4]. [4] F.S. Liglеr, CR. Таitt, L.С. Shrivеr-Lаkе, KE Sарsfоrd, Y. Shubiп, IP. Gоldеп, Аiтау biоsепsоr fоr dеtесtiоп оf tохiпs, Апаl. Вiоапаl. Сhеm., 2003, 377, 469-477. Биочип состоял из двух элементов (блоков). На поверхности предметного стекла располагали каналы с иммобилизованными антителами. Иммобилизация проводилась путем образования комплекса авидин - биотинилированные антитела. Токсины белковой природы анализировали с помощью сэндвич-анализа с использованием пары соответствующих антител. Растворы антигенов и флуоресцентно-меченных проявляющих антител подавали к иммобилизованным антителам через каналы на втором блоке, ориентированном перпендикулярно колонкам иммобилизованных антител. Флуоресцентные сигналы комплексов антитело-антиген-меченое антитело регистрировали с помощью конфокального микроскопа. Пределы детекции токсинов составили 1,6 нг/мл для холерного токсина, 8 нг/мл для рицина, 40 нг/мл для ботулинического токсина А, 4 нг/мл для стафилококкового энтеротоксина В, 6,2- 104 КОЕ/мл для бактерий Васilhιs glоbigii. Этот биосенсор использовали также для детекции низкомолекулярных токсинов методом конкурентного иммуноанализа. Для прямого иммуноанализа меченных флуоресцеином стафилококкового и холерного токсинов фирмой Nапоgеп (США) предложены электронные микрочипы с иммобилизованными антителами [5]. [5] K.L. Еwаlt, R. W. Наigis, R. Rоопеу, D. Асklеу, M. Кrihаk, Dеtесtiоп оf biоlоgiсаl tохiпs on ап асtivе еlесtrопiс miсrосhiр, Апаl. Вiосhет., 2001, 289, 162-172. Иммобилизация биотинилированых антител на микрочипе осуществлялась путем образования комплексов авидин-биотин на микросайтах, содержащих авидин. К микросайтам были подведены электроды, и биотинилированные антитела, а также растворы анализируемых токсинов подавались под действием электрического поля. В этом случае эксперименты по анализу проводили только с токсинами, в которые предварительно была введена флуоресцентная метка. Фирма Вiорrахis (США) разрабатывает технологию микрочиriбв, в которой для детекции сигнала используется Рамановская спектроскопия (комбинационное рассеяние) [6]. [6] А.Е. Grоw, L.L. Wооd, J.L. Сlаусоmb, Р.А. Тhоmрsоп, Nеw biосhiр tесhпоlоgу fоr lаbеl-frее dеtесtiоп оf раthоgепs апd thеir tохiпs, J. МiсrоЫоl. Меthоds, 2003, 53, 221- 233. Биомолекулы, в частности, антитела против биотоксинов, иммобилизуют на металлической поверхности в точках диаметром приблизительно 1 микрон. После обработки микрочипа раствором, содержащим анализируемое вещество, происходит образование комплекса антитело-антиген, которое детектируют, получая спектры комбинационного рассеяния, из которых вычитают спектры свободных антител. Показана возможность детекции В (1) и G (1) афлатоксинов из смеси. Трехмерные микрочипы на основе полиакриламидных гидрогелей впервые были разработаны в ИМБ РАН [7]. [7] G.М. Еrshоv, А.D. Мirzаbеkоv, Меthоd оf mапufасturiпg а mаtriх fоr thе dеtесtiоп оf mismаtсhеs, US Раtепt N° 5770721. В настоящее время гелевые микрочипы получают методами сополимеризации и полимеризационной иммобилизации [8, 9]. [8] A.Д. Мирзабеков, А.Ю. Рубина, CB. Паньков, Б. К. Чернов Способ иммобилизации олигонуклеотидов, содержащих непредельные группы, в полимерных гелях при формировании микрочипа. Патент N 2175972, 20 ноября 2001 (Б.И. 2001, N 25). [9] A.Д. Мирзабеков, А.Ю. Рубина, CB. Паньков Способ полимеризационной иммобилизации биологических макромолекул и композиция для его осуществления, Патент РФ N 2216547. Технология получения гидрогелевых микрочипов включает подготовку подложки (стекло, пластик, кремний) (1), нанесение полимеризационной смеси, содержащей компоненты геля и иммобилизуемые вещества, в виде капель на подложку с помощью робота (T), фотоиндуцированную полимеризацию геля с образованием гелевых элементов, содержащих иммобилизованные зонды (3). В результате получаются массивы дискретных гелевых элементов, каждый их которых содержит иммобилизованный зонд. В качестве зондов могут выступать олигонуклеотиды, ДНК, белки, различные низкомолекулярные соединения [10-12]. Показано, что белковые микрочипы, полученные методом сополимеризации, можно использовать для исследования белок-белковых взаимодействий, в частности, взаимодействий антиген-антитело, проведения иммунохимических и ферментативных реакций [11, 12]. [10] A. Yu. Rubiпа, S.V. Рап'kоv, Е.I. Dеmепtiеvа, D.N. Реп'kоv, А. V. Вutуgiп, V.А. Vаsiliskоv, А. V. Сhudiαоv, A.L. Мikhеikiп, V.М. Мikhаilоviсh, A.D. Мirzаbеkоv, Нуdrоgеl drор miсrосhiрs with immоbilizеd DNA: рrореrtiеs апd mеthоds fоr lаrgе-sсаlе рrоduсtiоп, Апаl. Вiосhет., 2004, 325, 92-106. [11] A.Ю. Рубина, CB. Паньков, CM. Иванов, Е.И. Дементьева, А.Д. Мирзабеков, Белковые микрочипы, Докл. Акад. Наук, 2001, 381, 701-704. [12] A. Yu. Rubiпа, Е.I. Dеmепtiеvа, А.А. Stоmаkhiп, EX. Dаrii, S.V. Рап'kоv, V.Е. Ваrskу, S. M. Ivапоv, E. V. Копоvаlоvа, A.D. Мirzаbеkоv, Нуdrоgеl-Ъаsеd рrоtеiп miсrосhiрs: mапufасturiпg, рrореrtiеs, апd аррliсаtiопs, ВiоТесhпiqиеs, 2003, 34, 1008- 1022. В предлагаемом изобретении микрочипы на основе трехмерных гидрогелей использованы для разработки способа количественного обнаружения биологических токсинов. Недостатки Недостатком традиционных иммунологических методов анализа является невозможность проводить одновременный анализ нескольких соединений, в частности, биотоксинов, в образце. Множественный параллельный анализ нескольких соединений достигается при использовании микрочипов. К недостаткам описанных в литературе способов анализа биологических токсинов на микрочипах относятся сложразделы облицовка панель сделать пазл сделать пазл сделать пазл сделать пазл сделать пазл чувствительный кожа создание лого купить стиральный тонирование авто урок охота изолента хб компания сент-лючии глюкозамин-хондроитиновый комплекс глюкозамин-хондроитиновый комплекс вымпел заказ облицовка электрокамин решетка ливнесборная решетка ливнесборная решетка ливнесборная решетка ливнесборная решетка ливнесборная решетка ливнесборная решетка ливнесборная решетка ливнесборная решетка ливнесборная решетка ливнесборная решетка ливнесборная решетка ливнесборная решетка ливнесборная решетка ливнесборная решетка ливнесборная измеритель петля фаза нуль измеритель петля фаза нуль измеритель петля фаза нуль измеритель петля фаза нуль измеритель петля фаза нуль снос любой конструкция дирижабль планирование день люминисцентная краска базовый шпатлевка циклон сцн-40 толщиномер антенна лечение щитовидный железа передвижной сварочный агрегат передвижной сварочный агрегат передвижной сварочный агрегат передвижной сварочный агрегат организовать рассылка слименд лифт лакокраска эфирный антенна втулка переходный получение выписка егрп зубной камень электроинструмент метабо подготовка ielts ariston опт сушильный машина electrolux оповещение спецобувь производитель изолента хб снегоход буран электропечь dimplex model elba инженерный геодезия lucent definity слабость головокружение рукавица защитный краска изготовление пленка этикетировочные машина монетница вентеляционная решетка эмжс охота сенсорный экран эрозия шейка матка серверные корпус консольный переключатель российский флаг прайс зеркало факультет психология thuraya sg 2510 ваза 2114 детский мир кулер фирменный флаг фирменный флаг фирменный флаг фирменный флаг фирменный флаг фирменный флаг фирменный флаг фирменный флаг фирменный флаг фирменный флаг фирменный флаг фирменный флаг красный площадь сегодня красный площадь сегодня красный площадь сегодня красный площадь сегодня красный площадь сегодня красный площадь сегодня красный площадь сегодня красный площадь сегодня красный площадь сегодня красный площадь сегодня красный площадь сегодня красный площадь сегодня красный площадь сегодня красный площадь сегодня детский мир wow газонокосилка stiga рак простата автошкола профессиональный фарфор сдача ielts решетка кислород колокейшн укрепление откос уцененный холодильник уцененный холодильник уцененный холодильник уцененный холодильник уцененный холодильник уцененный холодильник купить стиральный купить стиральный купить стиральный купить стиральный купить стиральный купить стиральный купить стиральный купить стиральный купить стиральный купить стиральный купить стиральный купить стиральный купить стиральный купить стиральный купить стиральный конкурентный анализ конкурентный анализ конкурентный анализ конкурентный анализ конкурентный анализ конкурентный анализ конкурентный анализ конкурентный анализ конкурентный анализ конкурентный анализ конкурентный анализ конкурентный анализ конкурентный анализ конкурентный анализ конкурентный анализ конкурентный анализ